二、神经元钙信号传导
钙是哺乳动物神经元中一种重要的细胞内信使。在静息状态下，大多数神经元的细胞内钙浓度约为 50 - 100 纳摩尔，而在电活动期间，其浓度可短暂上升至原来的 10 到 100 倍。图 1 总结了一些最重要的神经元钙信号传导来源，但未考虑其在不同细胞亚区室（如树突分支、细胞体或突触前末梢）中的空间分布。在任何给定时刻，细胞质中的钙浓度由钙内流和外流之间的平衡以及与内部储存库的钙交换决定。此外，诸如小白蛋白、钙结合蛋白 D28k 或钙网蛋白等钙结合蛋白作为钙缓冲剂，决定了神经元内游离钙的动态变化。重要的是，只有游离的钙离子具有生物活性。细胞外空间的钙内流有多种机制，包括电压门控钙通道、离子型谷氨酸受体、烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）和瞬时受体电位 C 型（TRPC）通道。细胞质中的钙离子通过质膜钙 ATP 酶（PMCA）和钠钙交换器（NCX）被移除。内质网（ER）等内部储存库的钙释放由肌醇三磷酸受体和兰尼碱受体介导。例如，神经元中的肌醇三磷酸可通过代谢型谷氨酸受体的激活而生成。内质网中的高钙水平由肌浆网/内质网钙 ATP 酶（SERCA）维持，该酶将钙离子从细胞质转运至内质网腔。除了内质网，线粒体对神经元的钙稳态也很重要。线粒体可通过钙单向转运体在细胞质钙离子浓度升高时摄取钙离子，然后通过钠钙交换缓慢将其释放回细胞质，从而起到钙离子缓冲的作用。接下来，我们将更详细地描述一些对神经元钙信号传导的主要贡献因素。
图 1 神经元钙信号
01.电压门控钙通道
电压门控钙通道（VGCCs）是一大类对钙离子具有高度选择性的通道，其激活和失活特性具有多种多样的电压依赖性。根据其电压依赖性激活的阈值，它们通常被分为高电压激活（HVA）和低电压激活（LVA）通道。HVA通道可根据其生物物理、药理学和分子特征进一步细分。传统上，它们被分为L型、P/Q型、N型和R型钙通道。在给定的神经元中存在哪种类型的VGCC取决于细胞类型以及细胞亚区室。例如，T型LVA通道在丘脑神经元中高度表达，而P型通道在小脑浦肯野神经元中高度丰富。L型和主要的R型VGCC在锥体神经元的树突棘中大量存在，而P/Q型和N型通道则存在于许多神经末梢。在大多数中枢神经元的树突和棘突中，电压门控钙通道（VGCCs）可通过动作电位的反向传播以及由突触介导的树突棘去极化而被有效激活。由于体细胞钙信号的记录在体外和体内广泛用于监测动作电位活动，因此需要注意的是，VGCCs 是这些信号的主要决定因素。体细胞钙信号的一个重要功能作用是诱导基因转录。
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02.N-甲基-D-天冬氨酸受体
NMDA 受体是离子型谷氨酸受体，在多种神经元细胞类型的树突棘中介导大部分的突触后钙内流，例如海马区的锥体神经元和皮质。脊柱内钙离子浓度的这种升高对于突触强度的长期改变尤为重要。NMDA 受体通道是钠离子、钾离子和钙离子均可通过的非特异性阳离子通道。通过 NMDA 受体通道的总阳离子电流中，钙离子所占的比例约为 6% - 12%。NMDA 受体的特定性质由亚基组成、受体的磷酸化状态以及神经元的膜电位所决定。NMDA 受体是由 NR1 亚基与 NR2 亚基（如 NR2A 或 NR2B）组成的异聚体。在 CA1 海马神经元中，树突棘优先表达 NR2A 或 NR2B 亚基，并且在给定的神经元中，NR2A 或 NR2B 介导的钙离子内流对树突棘钙信号的贡献在不同的树突棘之间是可变的。另一个决定钙离子通透性的因素是 NMDA 受体的磷酸化状态。因此，磷酸化程度的增加会增强通透性，而去磷酸化则会降低钙离子通透性。最后，NMDA 受体功能的一个关键调节因素是膜电位，因为它决定了镁离子对 NMDA 受体电压依赖性阻断的效力。NMDA 受体依赖的离子电流随着神经元从静息膜电位去极化的增加而增加。
03.钙通透性α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体
钙通透性AMPA受体是另一类离子型谷氨酸受体。它们存在于许多无棘状GABA能神经元中，并且以相对缺乏GluR2受体亚基为特征。缺乏GluR2的AMPA受体对钠、钙、钾离子以及锌离子均具有通透性。它们表现出快速的门控动力学，其内向整流的I-V关系源于分子内多胺的电压依赖性阻断。在单个神经元内，突触特异性方式决定了亚基组成的不同。这一特性使单个神经元能够对不同的突触输入产生不同类型的反应。重要的是，含 GluR2 和不含 GluR2 的 AMPA 受体的存在并非一成不变，而是受到高度调节，尤其是在神经元活动的响应中。因此，在给定的神经元内，AMPA 受体对钙的通透性是动态变化的，从而能够为无棘神经元中的突触可塑性机制做出贡献。例如，对兴奋性神经元突触输入的强直刺激会引发杏仁核中间神经元兴奋性突触后电流的长时程增强（LTP），这是一种被认为对恐惧条件反射具有重要细胞机制作用的可塑性形式。这种增强作用独立于 NMDA 受体，因此，在这些无棘神经元中，钙通透性 AMPA 受体可能在 LTP 诱导期间介导了钙信号传导的主要成分。在另一种无棘神经元中，即新皮质 GABA 能细胞中，利用双光子钙成像技术证明，单个突触的激活会产生高度局部化的树突钙信号。这种钙信号的特征由钙通透性 AMPA 受体的快速动力学、通过钠钙交换器的快速局部外排以及钙结合蛋白（如 parvalbumin）的缓冲作用所决定。因此，作者得出结论，无棘神经元中钙通透性 AMPA 受体的表达可能使单个突触激活时的钙信号实现区室化，这在某种程度上类似于兴奋性神经元树突棘上突触的特征，这一特性可能对无棘神经元的神经元处理具有重要影响。在锥体神经元中，钙通透性 AMPA 受体也被证明参与某些形式的突触钙信号传导。例如，感觉激活可以促进由新皮质第 4 层 - 第 2/3 层兴奋性突触中缺乏 GluR2 的 AMPA 受体介导的钙离子增加。这种钙信号可能代表了活动依赖性钙内流的另一种来源，有助于突触可塑性的启动。
04.代谢型谷氨酸受体
代谢型谷氨酸受体（mGluRs）是 7 跨膜 G 蛋白偶联受体，在神经系统中广泛分布。它们分为 I、II 和 III 型 mGluRs，以细胞类型特异性的方式表达，并发挥多种生理作用。受体类别在下游信号机制上有所不同；例如，I 型 mGluRs 与 Gq 蛋白偶联。在小脑浦肯野神经元中，该组的 mGluR1 亚型介导细胞内钙的增加以及 TRPC3 依赖性内向电流。mGluR1 激活后，磷脂酶 C 介导 IP3 的生成，IP3 与内质网中的受体结合并诱导钙释放。
05.代谢型谷氨酸受体
mGluRs 是 7 跨膜 G 蛋白偶联受体，在神经系统中广泛分布。它们分为 I、II 和 III 型 mGluRs，以细胞类型特异性的方式表达，并发挥多种生理作用。受体类别在下游信号传导机制上有所不同；例如，I 型 mGluRs 与 Gq 蛋白偶联。在小脑浦肯野神经元中，该组的 mGluR1 亚型介导细胞内钙离子增加以及 TRPC3 依赖性内向电流。mGluR1 激活后，磷脂酶 C 介导 IP3 的生成，IP3 与内质网中的受体结合并诱导钙离子释放。
06.内质网钙离子释放
内质网钙离子释放最广为人知的是通过肌醇三磷酸受体（IP3Rs）和兰尼碱受体（RyRs）进行，但也可能涉及其他细胞器。人们已在不同发育阶段的多种神经元中发现了由内质网钙库释放钙所引发的钙信号。虽然 IP3 介导的钙释放主要由谷氨酸等神经递质触发（见上文），但 RyR 可以通过细胞质钙浓度的升高而被激活。这种由 RyR 介导的钙诱导钙释放过程，例如，可以促进神经元中由动作电位放电产生的钙内流的放大。IP3R 和 RyR 均受多种细胞内因素的调节，其中最重要的是钙本身。这种通过钙的调节作用既来自通道的腔侧，也来自细胞质侧。这种钙依赖性建立了反馈回路，协调钙从内质网库向细胞质的内流，并且在 IP3R 的情况下，对于新皮质和其他类型神经元中突触诱发的树突钙波起着至关重要的作用。在对神经元钙信号的各种来源进行分析时，一个主要的挑战在于它们通常并非依次单独发挥作用，而是存在重叠的活动，并且相互之间有很强的相互作用。例如，在 CA1 海马神经元的树突和棘突中，强突触活动期间通过 NMDA 受体和电压门控钙通道（VGCC）的钙内流非线性叠加，其组合信号充当了突触前和突触后活动之间的同步检测器。同样，在小脑浦肯野细胞中，攀缘纤维活动与平行纤维爆发的配对会触发树突钙信号，当平行纤维的激活比攀缘纤维的激活提前一定的时间窗口时，这种信号达到最大值。鉴于这些复杂性，钙成像对于剖析神经元中的特定信号机制往往是不可或缺的。
三、钙指示剂
图 2A 描述了源自海洋生物（如发光水母维多利亚多管发光水母）的生物发光钙指示剂水母素的作用模式。它由水母素的载脂蛋白 apoaequorin 和非共价结合的发色团组成，发色团是腔肠素与分子氧的结合物。它含有三个钙结合位点。当钙离子结合时，蛋白质会发生构象变化，导致腔肠素氧化成腔肠胺，并因腔肠胺从激发态衰减到基态而发出光子（约 470 纳米波长）。此反应的速度取决于细胞质中的钙离子浓度。重要的是，水母素具有高信噪比和宽动态范围，能够监测细胞质中钙离子浓度从 10⁻⁷ 到 10⁻³ 摩尔的变化。使用水母素进行钙信号的生物发光记录不需要外部照明，从而避免了诸如光毒性、光漂白、自发荧光和对光生物学过程的不良刺激等问题。然而，每个分子仅执行一次发光循环，而且不幸的是，用腔肠素进行再充电的过程相对缓慢。此外，由于提取的水母素形式无法穿透完整细胞的质膜，因此需要通过微管将其加载到单个细胞中。水母素 cDNA 的克隆和序列分析在一定程度上解决了这个问题，使得 apoaequorin 能够在多种细胞类型和特定的细胞内区室中表达。然而，所有这些使用 apo 蛋白表达的应用都需要外源补充腔肠素。总体而言，基于水母素的钙信号记录存在量子产率低和蛋白质稳定性差的问题。为了提高量子产率，水母素已与不同的荧光蛋白结合。
图 2 钙离子指示剂
图 2B 展示了 fura-2 的结构，它是荧光化学（或合成）钙指示剂的一个典型代表。如前所述，fura-2 是钙螯合剂和荧光团的组合。它可被紫外线（例如 350/380 纳米）激发，其发射峰在 505 至 520 纳米之间。钙离子的结合会导致分子内构象变化，从而引起发射荧光的变化。在单光子激发下，fura-2 的优势在于它可采用双波长激发，从而能够独立于细胞内染料浓度定量测定感兴趣神经元中的钙浓度。fura-2 的另一个优点是其在双光子钙成像中具有良好的截面。然而，由于在双光子激发条件下的吸收光谱较宽，比率记录不可行。相反，由于它们的吸收峰分离良好，fura-2 和 GFP 标记可以很容易地结合使用。例如，fura-2 已成功用于标记了绿色荧光蛋白（GFP）的中间神经元的双光子钙成像。在双光子成像条件下，fura-2 的荧光发射会随着细胞内钙离子浓度的升高而降低，而其他指示剂（如 Oregon Green BAPTA 和 fluo）的荧光则会随着细胞内钙离子浓度的升高而增强。也许正因为如此，这些指示剂在体内等更嘈杂的记录条件下变得相当受欢迎。化学钙指示剂的另一个主要优点是它们既有膜通透形式，也有膜不通透形式，这使得它们能够与多种不同的加载技术结合使用（有关染料加载方法的章节）。最后，这些指示剂具有不同的钙离子亲和力和不同的光谱特性，从而可以同时使用（有关染料特性的概述，请参阅相关文献）。基因编码的钙指示剂（GECIs）分为两类，即涉及福斯特共振能量转移（FRET）的（图 2C）和单荧光团的（图 2D）。为了说明基于 FRET 的 GECIs，我们选取了黄钙粘蛋白（YC）3.60 作为代表（图 2C）。FRET 是指处于激发态的供体荧光团与受体荧光团之间的一种非辐射能量转移。它们之间的距离必须小于 10 纳米才能实现 FRET。YC 3.60 由两个荧光蛋白组成，是钙指示剂钙粘蛋白家族的一员。它由增强型青色荧光蛋白（ECFP）作为供体和环化排列的 Venus 蛋白作为受体构成。这两个蛋白通过一个由钙结合蛋白钙调蛋白和钙调蛋白结合肽 M13 组成的连接序列连接在一起。在没有钙离子的情况下，发射光主要由蓝色 ECFP 荧光（480 纳米）主导。钙结合后，分子内构象变化导致两个荧光蛋白之间的空间距离缩短。因此，由于发生了荧光共振能量转移（FRET），Venus 蛋白被激发，发出约 530 纳米的光子。实际上，蓝色荧光减弱，而黄色荧光增强。钙信号以 Venus 荧光与 ECFP 荧光的比值来表示。为避免钙调蛋白与内源性结合伙伴可能产生的相互作用，采取了两种不同的方法。在 D3cpV 型钙指示剂中，钙调蛋白与 M13 的结合界面被突变，以大幅减少与细胞内靶点的相互作用。在另一种基于 FRET 的钙指示剂中，钙调蛋白被肌钙蛋白 C 变体所取代。肌钙蛋白 C 是心肌和骨骼肌细胞中的钙结合蛋白，因此在神经元中没有内源性结合伙伴。单荧光团 GECI 的一个典型代表是 GCaMP 家族（图 2D），该家族在活体条件下的钙成像应用中越来越广泛。GCaMP 由一个环化排列的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组成，其一侧为钙结合蛋白钙调蛋白，另一侧为钙调蛋白结合肽 M13。在钙存在的情况下，钙调蛋白与 M13 的相互作用会引发荧光团环境的构象变化，从而导致发射荧光的增加。最近，在阐明 GCaMP2 的结构后，通过蛋白质工程开发出了 GCaMP3。它在信噪比、动态范围和响应动力学方面都有所改进，但其无法可靠地检测到与单个动作电位相关的钙信号。
表 1 给出了最常用的钙指示剂的概述，包括一些具有代表性的参考文献和应用实例。最后需要指出的是，要始终牢记钙指示剂测量的是细胞质游离钙浓度的变化。游离钙离子与结合在内源性钙缓冲蛋白（如星形天蓝色蛋白、钙结合蛋白-D28k 和钙网蛋白）上的钙离子处于平衡状态。在钙成像实验中，除了水母素外，钙指示剂都充当外源性钙缓冲剂，从而增加了细胞内钙缓冲分子的总量。因此，添加钙指示剂会改变细胞内的钙动态。在最简单的情况下，这种干扰可以用“单室模型”来描述，该模型考虑了内源性钙结合蛋白和外源性钙指示剂。它很有用，因为它允许估算细胞质内未受干扰的钙动态。例如，它已被成功用于描述树突中的钙动态。值得注意的是，钙指示剂对钙的亲和力各不相同。这反映在描述指示剂与钙离子复合物分离可能性的解离常数（Kd）上。Kd 的单位为摩尔，对应于半数指示剂分子与钙结合时的钙浓度。有低亲和力（例如，fluo-5N）和高亲和力（例如，Oregon Green BAPTA-1）的钙指示剂。测量的 Kd 值取决于许多参数，包括 pH 值、温度和镁的存在。因此，它可能在体外和体内条件之间有所不同。在设计实验时，选择适当浓度的合适指示剂对于结果的解释至关重要。这一决定应根据测量的科学目标和感兴趣的细胞类型来指导。例如，使用低亲和力指示剂记录的荧光信号，其为细胞提供的缓冲容量较小，能更准确地反映游离胞质钙浓度的变化。这些钙信号的上升和衰减时间会比使用高亲和力指示剂所记录的信号更快。然而，低亲和力钙指示剂的使用受到灵敏度不足的限制。在嘈杂的体内成像条件以及成像小结构（如树突棘）时，这一问题愈发显著。在这种情况下，尽管存在种种局限性，高亲和力钙染料仍是首选的指示剂。幸运的是，在一系列实验中，通常可以轻松地互补使用具有不同特性的钙指示剂。这些新进展无疑将增强我们解读完整神经系统中高度复杂的神经元信号机制的能力。
表 1.常用的荧光钙指示剂
01.染料加载方法
钙离子指示剂加载到神经元中取决于钙离子指示剂的类型、生物制剂以及具体的科学问题。图 3A 展示了用于单个神经元染料加载的三种最广泛使用的方法。在早期的成像实验中，化学钙染料通过尖锐的微电极进行递送，无论是在体外还是在体内（图 3A，左图）。近年来，通过全细胞膜片钳微电极进行染料递送已成为许多应用中单个细胞染料加载的标准程序（图 3A，中图）。这种方法的一个特别有用的变体涉及在视觉引导下使用双光子成像通过应用“阴影贴片”技术进行体内全细胞记录。这种方法可以与针对表达荧光标记蛋白的基因鉴定细胞的靶向相结合。
图 3 染料负载方法
其他一些有吸引力且相对易于操作的单细胞方法包括靶向电穿孔或单细胞团注。在电穿孔实验中，用微管接近目标神经元的胞体后，施加几个适当极性的电流脉冲即可将染料送入细胞。这种方法依赖于两种不同的机制。首先，电流会短暂破坏细胞质膜的完整性，导致短暂形成孔隙，染料分子通过这些孔隙扩散进入细胞。其次，电流将带电的指示剂分子从微管"推"入感兴趣的细胞。重要的是，这种方法既可用于化学钙指示剂，也可用于编码GECIs的DNA。该方法的一个局限性在于，由于没有记录全细胞微电极，神经元的功能状态并不完全明确。这一问题可以通过将单细胞电穿孔与使用第二支新鲜微管的细胞贴附记录相结合来解决。
单细胞钙成像被广泛用于分析神经元中钙信号的基本机制，以及对树突、棘突和突触终端中钙信号的功能分析。然而，钙成像也被广泛用于监测局部相互连接神经元群体的活动。早期的应用实例包括对皮质、海马体和视网膜回路的研究。该技术还成功用于识别突触连接的神经元。此外，它还被用于分析病理性的网络活动形式，如癫痫样事件。在此，我们重点关注三种在完整组织中对神经元群体进行染料加载的广泛使用的方法。图3B展示了通过多细胞团块加载对膜通透性乙酰氧甲基酯钙染料进行靶向整体染料加载的方法。这种简单的方法包括通过气压脉冲向脑组织注射AM钙染料，从而形成直径为300-500微米的染色区域。该方法涉及将AM钙染料分子捕获到细胞、神经元和神经胶质细胞中，这是由于细胞内酯酶去除了疏水性酯基。在神经元中，胞体钙信号是由动作电位活动引起的电压门控钙通道的钙内流介导的。由于体内有效的电压成像方法尚不存在，因此在体外和体内分析局部神经元回路时，通常采用钙成像作为神经元放电活动的替代指标。通过形态学分析或与星形胶质细胞标记物共载，可以明确地识别星形胶质细胞。此外，AM载入还可与具有特定细胞类型荧光标记的转基因小鼠品系或病毒转导动物相结合。值得注意的是，开发了一种方法能够在体内用荧光钙指示剂对星形胶质细胞进行特异性标记，并对星形胶质细胞特异性的钙信号机制进行准确分析。
除了AM型钙染料外，还可以使用与葡聚糖结合的化学钙指示剂进行网络染色，主要通过压力注射到轴突通路中，染料分子被摄取并顺行和逆行运输至轴突末梢和细胞体。这种方法适用于神经元群体的标记，并已成功用于记录小鼠小脑和嗅球轴突末梢的钙信号以及脊髓神经元的钙信号。最后，电穿孔不仅用于单细胞标记，还用于局部神经网络的染料加载。这是通过将含有盐形式或葡聚糖结合形式染料的微管插入感兴趣的脑或脊髓区域，并施加一系列电流脉冲来实现的。结果，染料被附近的细胞体和细胞过程摄取，可能是主要的树突。这种方法已在小鼠新皮质、嗅球和小脑的体内实验中成功应用。这种方法的变体被用于成年小鼠视网膜的全层钙成像记录以及蚕蛾的触角叶。
近年来，GECIs 已成为神经科学中广泛使用的工具。在神经元中表达 GECIs 有多种可能性，其中病毒转导可能是目前最流行的一种。携带 GECI 的病毒构建体可以通过立体定向注射靶向特定的大脑区域。原则上，慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒以及最近的 ΔG 狂犬病毒载体被用于将 GECIs 引入感兴趣的细胞。各种病毒载体之间的一个实际相关差异在于病毒携带的基因组大小。例如，慢病毒载体可容纳多达 9 千碱基对，而腺相关病毒载体则仅限于 4.7 千碱基对。目前，慢病毒载体和腺相关病毒载体可能是应用最广泛的。这两种载体都具有较高的"感染复数"，因此能长期提供高水平的表达，且不良反应报告较少。重要的是，有多种方法可以获得针对特定细胞类型的靶向特异性。除了病毒对特定细胞类型的嗜性，对特定细胞群的特异性还可以通过使用细胞类型特异性启动子或通过将转基因细胞类型特异性重组酶驱动小鼠和大鼠品系与重组酶依赖型病毒载体相结合来实现。后者将研究限制在大鼠和小鼠作为动物模型，而其他方法也适用于其他物种。其次，可采用子宫内电穿孔法将编码 GECI 的 DNA 质粒导入，与病毒递送相比，这种方法会导致相对稀疏的标记。自几年前的早期报告以来，子宫内电穿孔已发展成为一种将 DNA 递送至脑前体细胞的有效方法，进而递送至神经元。与单细胞和整体电穿孔技术类似，子宫内电穿孔利用电场将带负电荷的 DNA 分子导入细胞。转染区域的大小以及神经元特异性取决于胚胎的年龄和电极配置。需要强调的是，子宫内电穿孔的优势在于对所转染的感兴趣基因的大小没有限制，并且可以在转基因技术难以实施的物种中应用。最后，生成表达 GECIs 的转基因小鼠一直是个难题，最初的努力均以失败告终。这些失败的确切原因尚不完全清楚，但似乎有一个问题是，当在转基因小鼠品系中表达时，相当一部分指示蛋白是无功能的。然而，表达 GECIs 的小鼠将极大地促进许多实验，目前已有几条转基因品系可用。例如，报道了两条转基因小鼠品系的生成，它们在四环素诱导型启动子的控制下分别表达特定蛋白，用于在活体小鼠嗅球中进行钙成像。在表达转基因小鼠品系中展示了气味诱发的钙反应，报告了在表达特定蛋白的神经元的胞体和树突中存在谷氨酸诱导的钙瞬变。
图 4 常见的成像设备
在大脑或脊髓中更深处的神经元内成像钙离子，通常采用共聚焦显微镜或双光子显微镜来实现。激光扫描显微镜通过激光束在样本上扫描来生成图像。然后根据每个像素获取的荧光值来创建图像。共聚焦显微镜通常采用单光子激发，因此样本在焦平面的上下都会被照亮，这可能会对未成像区域造成光损伤。图4C展示了一种显微镜设计的示意图，其中通过在像共轭平面中实施共聚焦孔径（小孔或狭缝）来实现光学切片，该孔径可阻挡焦平面外的荧光到达探测器单元。因此，只有在焦平面产生的光子才能到达探测器。遗憾的是，共聚焦孔径也会阻挡实际上在焦平面产生的光子，但这些光子在返回光路时发生了散射。当在组织内部进行更深层成像时，散射增加，光子的这种浪费变得越来越严重。为了补偿由于散射而损失的直射光子，可以先增加激发光功率。但这会以增加组织光损伤（在焦内和焦外）为代价，在共聚焦显微镜中这种损伤可能很高。因此，共聚焦显微镜和宽场显微镜一样，大多局限于体外准备，例如培养的神经元或脑切片。最后，一些应用得益于使用基于旋转盘的共聚焦成像，该成像涉及使用带有大量细孔的旋转盘，每个孔都充当单独的共聚焦孔径（“尼普科夫盘”）。在成像过程中，许多焦点同时被照亮，孔的排列方式使得旋转盘的旋转可依次照亮整个样本。可以使用相机进行图像检测。由于能够同时从多个焦点采样，该系统能够实现比激光扫描共聚焦显微镜更高的图像采集率。因此，双光子显微镜的建立，使得在活体高散射脑组织中进行高分辨率和高灵敏度的荧光显微镜观察成为可能，这是神经科学领域的一个重要进步。在双光子显微镜中，两个低能量近红外光子协同作用，使荧光分子从基态跃迁到激发态。这种双光子效应必须在飞秒时间窗口内发生。重要的是，双光子吸收过程是非线性的，其速率取决于光强度的二次方。因此，荧光团几乎只在衍射极限的焦点体积内被激发（“激发的定位”）。离焦激发和漂白现象大大减少。只有开发出适用于双光子显微镜的脉冲激光器，这种激光器的特点是脉冲持续时间约为100飞秒且包含高光子密度，才使得这一过程能够用于生物样本的荧光显微镜观察。由于激发仅发生在焦点处，所以在给定时间点被显微镜捕获并传输至检测器的所有荧光光子，无论是直射的还是散射的，都可以用于生成图像。另一个优点是，通常的激发波长处于近红外光谱范围内，比用于单光子显微镜的可见光具有更好的组织穿透性。这是由于这些波长在大脑中存在的天然发色团中散射和吸收较少。重要的是，背景荧光水平非常低。由于所有这些原因，双光子钙成像成为在大脑较深区域进行记录的首选方法。因此，可以对活体大脑皮层回路进行检查，且连接保持良好。常见的双光子激光器可调谐范围为700纳米至1000纳米或更长，适用于激发大多数荧光团。有前景的新方法有望提高双光子显微镜的质量和通用性，从而提高双光子钙成像的效果。受天文学成像工作的启发，神经生物学中采用自适应光学技术，旨在提前（在照明光进入光学通路之前）校正可能使激光脉冲失真的球面像差，从而提高双光子成像的效率。随着深度的增加，这些像差变得越来越重要。这种校正的目的是在焦点处获得最佳的激光脉冲持续时间和形状。在双光子显微镜中增加深度穿透的一个有趣方法是使用再生激光放大器，这能产生光子密度更高但重复频率更低的激光脉冲。由于光子密度增加，双光子效应的概率得以提高，例如，这使得在活体中从第5层锥体神经元胞体记录感觉诱发的钙信号成为可能。该技术目前存在的局限性在于缺乏波长可调性以及成像速度降低。最后，光学器件的发展将双光子显微镜的激发波长推向了红外光谱（>1080纳米）区域，并能够有效地激发红移荧光团。因此，由于在更长波长下吸收和散射减少，成像深度得以增加。通过使用扫描装置或偏转器，尤其是当采用随机访问成像模式时，钙成像的速度可以得到提高。另外，多光束共聚焦激发也能实现高速成像，但仅限于神经组织的浅层，目前仅用于体外实验。接下来，人们在三维成像方面投入了越来越多的努力，涉及多种方法。
即使使用双光子显微镜结合改进的深度穿透技术，成像深度最终也是有限的。一个主要的限制因素是样本表面由离焦激发光产生的荧光。为了在组织中成像得更深，激光强度必须增加，这必然导致离焦激发增加，从而极大地降低了成像质量。一种不太优雅但显而易见的方法是从更深层脑区记录信号，即机械去除覆盖组织——例如去除位于海马体上方的皮质组织。检测深层脑结构中钙信号的另一种方法涉及微内窥镜技术（图4E）。这些方法包括单独或结合使用微棱镜插入光纤和光纤状的梯度折射率透镜。基于梯度折射率的微型内窥镜，通常直径为350至1000微米，通常由1至3个梯度折射率透镜组成，这些透镜利用其内部折射率的变化来引导光线到达并返回记录点。如果与物镜耦合，微型内窥镜可以将扫描图案投射到位于组织内部的焦平面上，并且还能允许焦平面轴向位置的变化。其诸如视场大小、数值孔径、工作距离和物理长度等特性可以自由选择。作为这些技术的补充，已开发出一种双芯微型探针，它结合了一个用于局部激发和收集荧光的光学芯以及一个用于记录电信号的电解质填充芯。
最后，越来越多的努力致力于在自由活动的动物身上进行记录，这涉及微型化头戴式成像设备的开发。这些成像设备通常由两个组件构成（图4F）。移动组件固定在活动动物的颅骨上，并包含光学组件。另一个组件通过光纤与移动组件相连，通常是固定的，包含用于图像记录的硬件和软件。这些设备的个体设计差异很大。例如，将传统显微镜的几乎所有组件都置于头戴式移动设备中（包括物镜、二向色镜和扫描仪），而其他设计仅将物镜和二向色镜置于固定的头部组件中。最近，报道了一种基于单光子且完全自主的固定头部相机设备的开发，可用于自由活动动物的功能性钙测量。
四、钙成像的应用实例
接下来，我们重点介绍在哺乳动物神经元中获得的钙成像的几个应用实例。毋庸置疑，钙成像在许多其他物种中也能成功进行，包括斑马鱼、海兔、小龙虾、发育中的非洲爪蟾、青蛙、鱿鱼、海龟、果蝇、绿头苍蝇以及蜜蜂。
01.体外突触前和突触后功能成像
成像树突棘，即许多神经元中兴奋性连接的突触后位点，是双光子钙成像技术在生物学中的首批应用之一。将双光子显微镜与海马脑切片中的钙成像相结合，证明了钙信号可以局限于树突棘（图5Aa和5Ab）。作者还表明，应用谷氨酸能传递阻断剂可使树突棘钙信号消失。随后发现，突触诱发的树突棘钙信号是由多种其他机制引起的，这取决于神经元的类型。例如，图5Ac和5Ad展示了利用共聚焦钙成像技术从小鼠小脑平行纤维-普肯野细胞突触获得的结果。作者确定了代谢型谷氨酸受体1介导的传递的钙信号机制，涉及树突和棘突内钙库的释放。研究表明，这种局部树突钙信号对于长时程突触抑制的诱导至关重要，这可能是小脑运动学习的潜在细胞机制。
图 5 体外突触的钙成像
同样，突触前末梢的钙动态也可通过钙成像技术进行检测。为此，需将适当的钙指示剂染料加载到突触前末梢。一个很好的例子如图 5Ba - 5Bc 所示。为了对小脑皮质中的爬行纤维进行成像，作者在新生大鼠体内向橄榄核上游注射了钙指示剂 fluo-4 以及形态标记物 Texas 红葡聚糖。葡聚糖偶联的钙染料和 Texas 红被橄榄核神经元摄取，并在几天内通过爬行纤维扩散至小脑皮质。因此，在随后制备的小脑切片中可以识别出爬行纤维。然后用 Alexa Fluor 488 对浦肯野细胞进行反向标记（图 5Ba）。这种方法使得能够记录刺激诱导的爬行纤维突触前末梢的钙信号（图 5Bb 和 5Bc）。另一个例子是研究人员对皮质锥体神经元的突触前小结进行钙成像的研究，他们将双光子显微镜与通过全细胞记录突触前神经元将突触前末梢加载 Oregon Green BAPTA-1 相结合（图 5Bd 和 5Be）。因此，他们能够记录幼鼠皮质 2/3 层锥体神经元轴突小结的动作电位诱发的钙信号（图 5Be）。这些突触前钙信号被发现仅由单个动作电位可靠地诱发。有趣的是，大的动作电位诱发的钙信号主要局限于小结，而非周围的轴突段。
02.树突和棘钙信号在体成像近年来，利用双光子显微镜对哺乳动物神经元在体内的树突和棘钙信号进行成像已成为可能。斯沃博达等人于 1997 年首次报道了在活体中从大鼠第 2/3 层锥体神经元获得的树突钙信号（图 6A）。他们能够记录来自桶状皮质神经元的与刺激相关的树突钙信号（图 6Ab - 6Ad）。这些钙信号的幅度与动作电位的数量相关，并且在近端树突中最大，这表明这些信号是由于动作电位向树突树的反向传播所致。这些树突信号的一个作用可能是放大由突触活动引发的钙信号。
图 6 体内的树突和脊柱钙信号
除了对这种反向传播诱发的钙信号的研究之外，最近还能够利用钙成像技术来研究活体中皮质神经元突触输入的空间和时间分布。在这些研究中，神经元的膜电位被轻微超极化以防止动作电位的产生。因此，能够分离出对感觉刺激作出反应的局部树突甚至单个棘突的钙信号。局部钙信号反映了相应神经元树突上特定的感觉诱发突触输入位点。例如，图6B展示了在小鼠2/3层听觉皮层神经元的棘突和树突中记录到的感觉诱发钙信号。在活体中稳定记录这种单棘突钙信号需要开发一种名为低功率时间过采样的新方法。该方法有助于提高荧光信号的产量并减少光毒性损伤。与之前的体外研究结果一致，发现声音诱发的树突棘钙信号主要局限于树突棘内。重要的是，钙成像能够同时记录多个突触位点，从而能够绘制出特定神经元突触输入位点的功能图谱。虽然这些研究依赖于化学钙指示剂的使用，但我们预计未来将广泛使用基因编码钙指示剂来研究树突钙信号。几年前的一项原理验证研究已经表明，利用表达特定钙指示剂的转基因小鼠品系，可以在体内记录树突上的谷氨酸诱导钙信号。另一种在体内记录树突钙信号的方法涉及使用所谓的“光纤潜望镜”。潜望镜由一个特定镜头和一个90°角的微棱镜组成，插入皮质内。该方法将靶向荷载皮质第5层锥体神经元的顶树突与化学钙指示剂相结合，并从皮质顶部层进行水平荧光收集。它使用单光子激发，严格来说，它不是一种传统的成像方法，因为它收集的是许多第5层树突的平均荧光，而不是生成图像。然而，它既适用于麻醉小鼠，也适用于清醒活动的小鼠，并且有人尝试将潜望镜方法与双光子成像相结合。
03.不同动物模型中的在体回路分析
将双光子显微镜与特定钙染料荷载相结合，能够对局部皮质回路进行功能分析。这种方法已在许多不同的动物模型中得到应用，包括小鼠、大鼠、猫和雪貂。图7A展示了此类在体双光子成像实验的首个实例。作者们研究了小鼠桶状皮质神经元对胡须刺激的反应性，并证明了钙成像技术在单细胞分辨率下记录动作电位诱发活动的可行性。特定荷载方法也在猫身上得到了应用，用于研究视觉皮层神经元的方向偏好。该研究表明，猫视觉皮层中的方向列以极高的空间精度分离，以至于即使在单细胞水平上，具有不同方向偏好的神经元区域也能被精确区分。使用双光子钙成像技术的进一步研究实例包括从小鼠桶状皮质、视觉皮质和听觉皮质以及小鼠嗅球和大鼠小脑的记录。可以采用多种方法来提取此类胞体钙瞬变所反映的动作电位活动。例如，一种有效的方法是“剥离算法”，其原理是从荧光轨迹中逐次减去单个动作电位诱发的钙瞬变，直到残余轨迹中不再有额外事件为止。同样，基因编码钙指示剂也可以用于不同动物模型中神经网络功能的研究。与此同时，它们已被用于啮齿动物、果蝇、线虫、斑马鱼，甚至灵长类动物。
图 7 不同动物体内模型的电路分析
体内双光子钙成像的一个有前景的应用是研究神经网络的可塑性。例如，实验范式中的视觉剥夺（例如，条纹饲养以影响方向选择性或单侧眼睑闭合以影响眼优势可塑性）已被证明会对小鼠视觉皮层神经元的功能特性产生显著影响。同样，钙成像已被用于研究疾病小鼠模型中神经网络的可塑性，例如在躯体感觉皮层缺血性损伤后。
04.活体动物中的钙成像
目前，人们对于在清醒动物中研究与特定行为相关的脑回路有着广泛的兴趣。为了实现这一目标，目前有两种主要策略涉及钙成像作为细胞功能分析的核心方法。一种方法涉及使用头戴式便携式微型显微镜（见成像设备部分）；另一种方法则专注于研究固定头部的动物，涉及使用标准的双光子显微镜。图8A展示了一项在固定头部的小鼠运动皮层中进行的实验，这些小鼠正在进行嗅觉辨别测试。实验中，小鼠被训练成在闻到气味A时舔舐，在闻到气味B时停止舔舐（图8Aa）。在行为中的小鼠运动皮层神经元中记录到的体钙瞬变具有极佳的信噪比（图8Ab-8Ac）。这类涉及固定头部的实验之所以可行，是因为小鼠已逐渐适应实验装置，其中包括在管状结构中进行训练，该结构为小鼠提供了保护。另一项研究考察了复杂行为期间海马神经元的功能。在这种情况下，小鼠被放置在一个球形跑步机上，它们可以在上面奔跑（图8Ba）。作者使用双光子钙成像技术对海马CA1区域标记的锥体神经元进行成像，以研究位置细胞的空间分布（图8Bb）。为了达到这个目的，他们在实验前几天移除了覆盖海马体的一些皮质组织。在实验中，他们通过将球形跑步机的定位数据与神经元钙信号相结合，成功绘制出了CA1位置细胞（图8Bb-8Bd）。这类研究的一个遗留难题在于，很难从同一个细胞获取钙成像和电生理记录。因此，在这些记录条件下，钙瞬变与潜在的动作电位活动之间的关系尚未完全明确。此外，运动伪影往往难以避免，需要使用各种运动校正算法。然而，涉及使用基因编码钙指示剂的此类实验可以在连续的几天和几周内反复进行，从而能够对体内神经元可塑性的机制进行深入分析。
图 8 行为动物中的钙成像
五、展望
神经元钙成像未来的主要挑战是什么？在单细胞水平上，钙成像仍将是分析特定类型神经元中与突触功能和突触可塑性相关机制的重要工具。体外研究结合神经元信号蛋白的靶向突变，能够为特定神经元亚区（如棘突和神经末梢）中涉及钙信号的细胞内机制提供高度定量的信息。体内研究可能会迅速超越目前使用的第2/3层分析，扩展到更深层皮质层的神经元，尤其是小鼠皮质第4层和第5层的树突和胞体。结合光遗传学，即利用光学和遗传学相结合来实现对目标细胞活动的控制，此类研究将有助于更好地理解特定简单行为背景下局部网络的功能。另一个在未来几年可能会大幅扩展的重要领域是在清醒、活动中的动物体内特定类型神经元的钙成像。这些研究不仅限于小鼠和大鼠，而且很可能会越来越多地扩展到其他模型，比如雪貂、猫，尤其是灵长类动物。钙成像在分子医学中的应用领域将产生越来越大的影响，可用于对数量急剧增加的疾病模型中的信号机制进行详细分析。我们还预计钙成像技术会有进一步的发展，特别是能够进行三维成像的设备以及可用于自由活动动物的微型化设备。最后，钙成像可能会极大地受益于改进型基因编码钙指示剂的开发，这些改进型指示剂具有更高的信号灵敏度和更好的时间响应特性。
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